荧光光谱仪是一种用于扫描液体荧光标记物发出的荧光光谱的仪器。它可以提供许多物理参数，包括激发光谱、发射光谱、荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等。从各个角度反映了分子的成键和结构。那么荧光光谱仪怎么设置呢？下面来解答一下！

1、激发波长的选择

如何确定激发波长和发射波长？对于许多乐器初学者来说，这是一个令人困惑的问题。如果仪器有三维扫描功能，就比较简单了。把样品放进去，按照说明做三维荧光扫描，可以很容易的确定合适的激发波长和发射波长。如果仪器没有3D扫描功能，一般方法如下。

首先将仪器的激发波长(λem)设置为200nm，然后进行发射(EM)模式扫描，发射波长(λEM)的扫描范围暂定为210 ~ 800 nm，记录所有的峰值波长。更改激发波长(λem ),然后扫描。如果在第二发射光谱中的某个峰(或多个峰)的位置没有位移(或位移很小)，一般来说，该峰(或多个峰)是荧光峰；因为荧光峰的位置不随激发波长的变化而变化，只是峰高(或峰面积)发生变化。

然后，将确定的荧光峰的波长固定为发射波长(λem)，然后扫描激发波长(Ex)，其范围小于发射波长；如果只有一个激发峰，很容易建立起来，然后固定这个波长再做一次真实发射波长(EM)扫描，就可以得到很好的信噪比。如果扫描激发波长(EX)后出现几个峰，应根据经验选择。一般应选择峰形、适宜性高、有一定带宽的峰作为激发波长。激发波长也可以通过参考荧光光谱的特性-激发光谱和发射光谱的镜像来确定。

2、过滤器的选择

当扫描和分析发射光谱时，根据斯托克斯定律，设定的激发波长比发射波长短。例如，如果激发波长λex=260nm，则发射起始波长应该从大于260nm的波长开始，例如270nm，发射终止波长应该是870nm。这样，在激发光的两倍(520nm)和三倍(780nm)处会出现激发波长的尖锐倍频峰。如果与荧光光谱峰重叠，会对测试产生干扰，所以需要选择合适的滤光片将其滤除。

倍频峰是激发光的散射峰。虽然扫描到两倍波长时出现波长，但实际波长是激发波长。可以通过添加高通滤波器来消除倍频峰值。一般高通滤波器放在发射处，芯片上标有能滤出的最大波长。也就是说，在系统中加入高通滤波器后，比上面标注的波长更低的光，包括这些光的双波长光和三波长光，都会被过滤掉；而波长高于其标示波长的光可以顺利通过。

3、狭缝的设置

荧光强度与许多因素有关，如分子结构、存在状态、溶液浓度或薄膜厚度、温度、选择的激发波长、测试狭缝的宽度等。不同仪器测得的荧光强度值差异较大，不具有可比性，但其峰值位置容易确定，可以用来判断是哪种物质。定量荧光分析必须固定一些条件。

狭缝的大小对荧光强度非常重要。狭缝的大小可以根据被测物质的荧光强度进行适当调整。在相同浓度下，如果荧光强度过高，超出仪器的测量范围，可以减小狭缝。但是，需要指出的是，荧光强度的变化不仅仅是狭缝的大小，还有分辨率。对于荧光扫描，狭缝的增加可以提高荧光强度和重现性，但分辨率下降。确定狭缝的分辨率，仪器的其他结构已经固定(光栅刻线数量、焦距、综合线性色散系数)，狭缝的大小决定了分辨率。对于实际应用，狭缝尺寸需要与测量峰的半峰宽相匹配。如果太大，峰会变形。狭缝的大小也决定了光通量。根据经验值，狭缝扩大1倍，光通量会增加4倍。

4、步长设置

测量步长越小，测量越慢，地图越细腻；步长越长，测量速度越快，谱图越粗糙。步长应小于待测最小FWHM的1/5，因为步长与分辨率有关。原则上，步长应小于狭缝宽度的3倍。